Protocolo de Investigación Científica.
PROTOCOLO DE TRABAJO
Ensayos cinéticos de proliferación celular
Estos ensayos se realizarán sobre dos tipos celulares:
Células tumorales: línea tumoral linfoide de origen murino BW 5147 que expresa el haplotipo H-2k, CD3+ y el TCRaß, los cuales son testeados rutinariamente por citometría de flujo usando anticuerpos específicos contra los correspondientes marcadores de superficie.
Linfocitos T normales provenientes de ganglios linfáticos de ratones de la cepa BALG/c de 3-4 meses de edad, obtenidos en forma aséptica.
Los ensayos in vitro se realizarán en condiciones de esterilidad en microplacas de cultivo de 96 wells en un volumen final de 0.2 ml.
El efecto sobre la proliferación celular de la mezcla a ensayar será evaluada a diferentes tiempos de cultivo (24, 48, 72 y 96 hs.) y en ausencia (Control) o presencia de diferentes concentraciones de mezcla a fin de determinar la cinética de acción del producto. Las concentraciones a ensayar serán diluciones seriadas al medio en un rango de concentraciones que incluye la dosis propuesta para uso en humanos (desde 1/250 hasta 1/4000).
La proliferación celular será evaluada a través de la técnica de incorporación de Timidina tritiada (20 Ci/mmol). Para ello, los cultivos celulares serán pulsados por un periodo de 16 hs en el caso de los linfocitos normales y de 6 hs para las células tumorales con Timidina tritiada, luego de lo cual los núcleos celulares son retenidos por filtración de papel de fibra de vidrio, Whatmann GF/A. La Timidina radioactiva incorporada al ADN será cuantificada en contador de centelleo líquido Wallac.
La concentración de células a utilizar será: para la línea tumoral de 3×105 células/ml (concentración celular óptima final) y para las células normales 2×106 células/ml. Ambos tipos celulares serán cultivados en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 2mM de glutamina y en presencia de los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml).
Curvas Dosis – Respuesta.
PRODUCTO FINAL (PF)
Una vez comprobada la efectividad de la formulación de la tintura madre mediante experimentación con animales, se realizó un barrido abarcando un amplio espectro con diferentes diluciones y vehículos.
De este barrido se originaron los datos de la Tabla 1: «Curva Dosis – Respuesta»
|
Dilución
|
PF1 (90% Solvente 1. 10% TM) |
PF2 (85% Solvente 1, 5% Solvente 2, 10% TM) |
PF3 (80% Solvente 1, 10% Solvente 2, 10% TM) |
|||
|
I.E.
|
% Inhib
|
I.E.
|
% Inhib
|
I.E.
|
% Inhib
|
|
|
1/10
|
0.22
|
77.0
|
0.24
|
76.25
|
0.23
|
77
|
|
1/25
|
0.35
|
64.8
|
0.44
|
55.8
|
0.46
|
53.6
|
|
1/50
|
0.60
|
39.9
|
0.67
|
33
|
0.62
|
38.2
|
|
1/100
|
0.87
|
12.8
|
0.78
|
21.9
|
0.66
|
34.2
|
|
1/200
|
0.98
|
2.2
|
0.96
|
0
|
0.73
|
27
|
|
1/400
|
1.03
|
0
|
0.99
|
0
|
0.86
|
13.8
|
TABLA 1: «Curva Dosis – Respuesta»
Tal como se evidencia en la Figura 1: «Gráfica Curva Dosis – Respuesta» la dosis óptima (mayor efecto terapéutico con nulos efectos secundarios) es 1/400 y la formulación óptima es la PF3 la cual ha evidenciado un porcentaje de inhibición de proliferación celular de 13.8 % a la mencionada dilución.
Figura 1: «Gráfica Curva Dosis – Respuesta»
Haciendo una extrapolación de los resultados obtenidos la dilución 1/400 equivale a una posología de 240 gotas por día. Este resultado se obtiene teniendo en cuenta que el volumen de 1 gota es de 0,05 ml., por lo que 240 gotas equivalen a 12 ml. de Basqüadé diluidos en la volemia (volúmen de sangre de un adulto = 5.000 ml.).
La ingesta de 12 ml. de Basqüadé se diluye en 5.000 ml. de sangre lo que equivale a 1 ml. en 416 ml de sangre.
Es importante destacar que en este estudio se comprobó la importancia de agitar el producto previo a su administración para una homogeneización del mismo, de acuerdo a sus propiedades organolépticas.
Cinética Celular «In Vitro»
Una vez determinada la formulación y posología óptima de acuerdo a la acción inhibitoria del crecimiento en líneas celulares BW en 24 horas se pasó a experimentar la Cinética en 48 horas.
En la TABLA 1: «Inhibición del crecimiento en línea celular BW en 24hs.» se presentan los resultados de las dos formulaciones (PF1 y PF3), como porcentaje de la inhibición del crecimiento de líneas celulares BW en 24 horas, que en la primera fase de experimentación mostraron diferencias significativas referente a los porcentajes inhibición del crecimiento celular.
|
Dilución
|
PF1
|
PF3
|
||
|
Índice de Estimulación
|
Inhibición
(%) |
Índice de Estimulación
|
Inhibición (%) |
|
|
1/10
|
0.15
|
84.7
|
0.14
|
85.3
|
|
1/25
|
0.28
|
71.4
|
0.26
|
73.6
|
|
1/50
|
0.52
|
47.9
|
0.53
|
47.0
|
|
1/100
|
0.76
|
23.7
|
0.58
|
41.8
|
|
1/200
|
0.89
|
10.9
|
0.68
|
31.7
|
|
1/400
|
0.95
|
4.3
|
0.77
|
22.9
|
TABLA 1: Inhibición del crecimiento en línea celular BW en 24hs.
Nuevamente tal como se ve en la Tabla 1: «Inhibición del crecimiento en línea celular BW en 24hs.», a mayores diluciones los sucesivos porcentajes de inhibición fueron decrecientes, resultando la mayor efectividad de la formulación PF3.
En la TABLA 2: «Inhibición del crecimiento en línea celular BW en 48hs.», se presentan los resultados expresados como porcentaje de inhibición de crecimiento en líneas celulares BW en 48 horas. Nuevamente se incluyeron las formulaciones PF1 y PF3 debido a que estas en la primera fase de experimentación mostraron diferencias significativas referente a los porcentajes inhibición del crecimiento celular, pretendiéndose descartar la posibilidad de un comportamiento diferente a las 48 horas.
|
Dilución
|
PF1
|
PF3
|
||
|
Índice de Estimulación
|
Inhibición (%) |
Índice de Estimulación
|
Inhibición (%) |
|
|
1/10
|
0.001
|
99.8
|
0.001
|
99.87
|
|
1/25
|
0.007
|
99.2
|
0.002
|
99.7
|
|
1/50
|
0.16
|
84.0
|
0.028
|
97.0
|
|
1/100
|
0.68
|
31.57
|
0.24
|
75.0
|
|
1/200
|
0.87
|
13.0
|
0.65
|
31.0
|
|
1/400
|
0.92
|
7.8
|
0.72
|
28.2
|
TABLA 2: Inhibición del crecimiento en línea celular BW en 48hs.
Como primera conclusión en ambas formulaciones luego de las 48 hs el efecto de inhibición a la dosis terapéutica fue mayor que a las 24 hs, lo que demuestra un efecto de acumulación (cinética de acumulación) en beneficio del objetivo deseado que es el efecto antiproliferativo.
También en las 48 horas, la mayor inhibición en términos absolutos del crecimiento en líneas celulares BW a la dosis terapéutica resultó de la formulación PF3.
Es así que se frena la cinética celular impidiendo el crecimiento tumoral.
Efecto Citostático.
En el cuadro Nº1 se comprueba el efecto acumulativode la acción antitumoral de Basquadé mediante sucesivos incrementos ascendentes en el efecto Inhibitorio sobre la proliferación de las células tumorales BW (medido como % Inhibición de la proliferación celular).
Estas inhibiciones se constataron comparando el % de inhibición resultante de la aplicación de Basquadé sobre los cultivos de células tumorales BW, contra los % de Proliferación detectados en muestras de células en ausencia de cualquier extracto (basales), para los períodos de tiempo y las concentraciones descriptas en la tabla.
A modo de interpretación de los conceptos arriba explicados equivale a decir que para la dilución 1/400 (dosis terapéutica) a las 96 horas se encontró una proliferación de las células tumorales BW tratadas con Basquadé un 29.6 % inferior que las mismas células tumorales que no fueron tratadas con el medicamento.
|
TIEMPO (horas) |
Proliferación (% INHIBICION)
|
||
| 44 |
1:50
|
1:200
|
1:400
|
|
24
|
55.0
|
37.0
|
24.9
|
|
48
|
74.0
|
35.5
|
22.3
|
|
72
|
92.0
|
26.4
|
25.0
|
|
96
|
92.5
|
30.7
|
29.6
|
Cuadro Nº1 : Efecto Inhibitorio de Basquadé sobre líneas de células tumorales BW .
En este ensayo queda nuevamente demostrada la tendencia a la acentuación del efecto antiproliferativo provocado por Basquadé en los cultivos de líneas celulares tumorales BW. Esta tendencia acumulativa del efecto antitumoral infiere la importancia de mantener cierta continuidad en la aplicación del tratamiento para capitalizar esta propiedad.
En posteriores ensayos mediante la tinción con la tintura excluyente “Azul Tripán” se intentará demostrar un eventual efecto CITOTÓXICO resultante de la aplicación de Basquadé en los cultivos de células tumorales BW, mediante ensayos de VIABILIDAD CELULAR.
Efecto Citotóxico.
Mediante el estudio de viabilidad de las células tumorales BW con la técnica de la
tinción con “Azul Tripán” se ha comprobado un importante efecto CITOTÓXICO resultante de la aplicación de Basquadé en los cultivos de células tumorales BW tal como surge de la interpretación de los datos en el Cuadro 1.
Los % de Viabilidad a cada tiempo se calculan teniendo en cuenta la cantidad de células vivas (que no incluyen el colorante de exclusión Azul Tripán) con respecto al total de células (Vivas + muertas). Las células muertes son las que incorporan el colorante y por lo tanto se ven de color azul a la observación microscópica.
|
TIEMPO (horas) |
% VIABILIDAD
|
||
|
1:50
|
1:200
|
1:400
|
|
|
24
|
79
|
70
|
89
|
|
48
|
58
|
69
|
78
|
|
72
|
27
|
58
|
78
|
|
96
|
21
|
33
|
49
|
Cuadro 1: % de Viabilidad Celular Determinado por la técnica de tinción con Azul Tripán.
Una vez determinado el efecto CITOSTÁTICO mediante la aplicación de Basquadé (constatado por la consistente inhibición de la proliferación celular en cultivos de células tumorales BW), se procedió a determinar mediante el % de Viabilidad
ad celular el efecto CITOTOXICO resultante de la aplicación de Basquadé en los cultivos de líneas de células tumorales BW.
Mediante el mencionado ensayo se constató consistentemente a períodos de tiempo crecientes una disminución de la viabilidad celular o lo que es lo mismo una disminución de células tumorales vivas.
Por lo tanto se puede concluir que Basquadé no solo inhibe el crecimiento celular tumoral sino que también actúa matando las células tumorales, propiedades que lo convierten en un muy interesante medicamento antitumoral.
invitro-conicet