Investigação Cientifica

Através do processo de desenvolvimento do produto foram-se passando por diferentes etapas de investigação de campo concomitantemente com provas de laboratório.
Nesta oportunidade se escolhem para sua apresentação dos dados obtidos em ensaios de investigação em laboratório em relação às propriedades antitumorais do Basqüadé devido a que esta é sua principal ação terapêutica

Protocolo de investigação Cientifica

ENSAIOS CIENTIFICOS FEITOS COM BASQÜADÉ

PROTOCOLO DE TRABALHO

Ensaios cinéticos de proliferação celular

Estes ensaios foram feitos sobre dois tipos celulares:

Células tumorais: linha tumoral linfoide de origem murinho BW 5147 que expressa o haplotipo H-2k, CD3+ e o TCRaβ, os quais são testados rotineiramente por citometria de fluxo usando anticorpos específicos contra os correspondentes marcadores de superfície.

Linfocitos T normais provenientes de gânglios linfáticos de ratos da cepa BALG/c de 3-4 meses de idade, obtidos de forma asséptica.

Os ensaios in vitro forma feitos em condições de esterilidade em microplacas de cultivo de 96 wells em volume final de 0,2ml.

O efeito sobre a proliferação celular da mistura a testar será avaliada a diferentes tempos de cultivo (24, 48, 72 e 96 horas) e em ausência (Controle) o presença de diferentes concentrações da mistura com o fim  de determinar a cinética de ação do produto.

As concentrações a testar serão diluições seriadas ao meio em um rango de concentrações que inclui a dose proposta para o uso em humanos (desde 1/250 até 1/4000).

A proliferação celular será avaliada através da técnica de incorporação de Timidina tritiada (20 Ci/mmol). Para isso, os cultivo celulares serão pulsados pelo período de 16hs no caso dos linfócitos normais e de 6hs para as células tumorais com Timidina tritiada, após o qual os núcleos celulares são retidos por filtração de papel de fibra de vidro, Whatmann GF/A. ATimidina radioativa incorporada ao DNA será quantificada no contador de cintilação liquido Wallac.

A concentração das células a ser usada será: para a linha tumoral de 3×105 celulas/ml (concentração celular ótima final) e para as células normais 2X106 celulas/ml.

Ambos tipos celulares serão cultivados em médio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2mM de glutamina e em presença dos antibióticos penicilina (100U/ml) e estreptomicina (100 µg/ml).

Curva dose – resposta

PRODUTO FINAL (PF)

Uma vez comprovada a efetividade da formula da tintura com a experimentação em animais, foi realizado um barrido abarcando um amplo espectro com diferentes diluições e veículos.

De este barrido originou-se os dados da tabela 1: “curva dose- Resposta”

Tabela 1: “Curva dose-resposta”

Tal como evidencia a Figura 1: “Gráfica Curva dose Resposta” a dose ótima (maior efeito terapêutico com nulos efeitos secundários) é 1/400 e a formula ótima é a PF3 a qual evidenciou uma porcentagem de inibição de proliferação celular de 13.8% da mencionada diluição.

Figura 1: “Gráfica Curva Dose – Resposta”

Fazendo uma extrapolação dos resultados obtidos a diluição 1/400 equivale a uma dose de 240 gotas por dia.

Cinetica Celular “in vitro”

Após a determinação da formula e dose ótima de acordo com a ação inibitória do crescimento nas líneas celulares  BW em 24 horas, passou-se a experimentar a Cinética em 48 horas.

Na TABELA 1: “Inibição do crescimento na línea celular BW em 24hs.” Apresentam-se os resultados das formulações (PF1 e PF3), como porcentagem da inibição do crescimento das líneas celulares BW em 24 horas, que na primeira fase de experimentação mostraram diferenças significativas ao que se refere a porcentagens de inibição de crescimento.

TABELA 1: Inibição do crescimento em línea celular BW em 24hs.

Novamente tal como se observa na TABELA 1: “inibição do crescimento em linea celular BW em 24hs”, a maiores diluições as sucessivas porcentagens de inibição foram decrescentes resultando de maior efetividade a formulação PF3.

Na TABELA 2: “inibição do crescimento em linha celular BW em 48hs”, apresentam-se resultados expressados como porcentagem de inibição do crescimento em linhas celulares BW em 48 horas. Novamente formam incluídas as formulações PF1 y PF3 devido a que estas na primeira fase de experimentação mostraram diferenças significativas referentes às porcentagens de inibição de crescimento celular.

TABELA 2: Inibição do crescimento em linha celular BW em 48h.

Como primeira conclusão em ambas as formulações após as 48h o efeito de inibição à dose terapêutica foi maior que as 24h, o que demonstra um efeito de acumulação (cinética de acumulação) em beneficio do objetivo desejado que é o efeito anti-proliferativo.

Também nas 48 horas, a maior inibição em termos absolutos do crescimento em linhas celulares BW na dose terapêutica  resultou a formulação PF3.

E assim que é interrompida a cinética celular impedindo o crescimento tumoral.

Efeito Citostático

No quadro Nº 1 é comprovado o efeito acumulativo da ação antitumoral do Basqüadé com sucessivos incrementos ascendentes no efeito inibitório na proliferação das células tumorais BW, medido como porcentagem de inibição da proliferação celular.

Estas inibições foram constatadas comparando a porcentagem de inibição resultante da aplicação do Basqûadé nos cultivos celulares tumorais BW, contra as porcentagens de proliferação detectadas em amostras de células em ausência de qualquer estrato (basais), para os períodos de tempo e as concentrações descritas na tabela.

Quadro Nº 1 : Efeito de inibição do Basqüadé em linhas de células tumorais BW .

Neste ensaio fica novamente demonstrada a tendência à acentuação do efeito anti-proliferativo provocado pelo Basqüadé nos cultivos de linhas celulares tumorais BW. Esta tendência acumulativa do efeito antitumoral infere a importância de manter certa continuidade na aplicação do tratamento para capitalizar esta propriedade.

Em posteriores ensaios mediante a tinção com a tintura “azul  tripan” se tentará demonstrar um eventual efeito CITOTÓXICO resultante da aplicação do Basqüadé nos cultivos de células tumorais BW, mediante ensaios de viabilidade celular.

Efeito Citotóxico.

Mediante o estudo de viabilidade das células tumorais BW com a técnica da tinção com “Azul Tripan” foi comprovado um importante efeito CITOTÓXICO resultante da aplicação do Basqüadé nos cultivos de células tumorais BW tal como surge da interpretação dos dados no Quadro 1.

As porcentagens de viabilidade a cada tempo são calculadas tomando em conta a quantidade de células vivas (que não incluem o corante Azul Tripan) frente ao total de células (vivas e mortas). As células mortas são as que incorporam o corante e por tanto aparecem em cor azul ao microscópio.

Quadro 1: % de Viabilidade Celular Determinado pela técnica de tinção com Azul Tripan.

Uma vez determinado o efeito CITOSTATICO pela aplicação de Basqüadé, procedeu-se a determinar mediante a porcentagem de viabilidade celular, o efeito CITOTOXICO resultante da aplicação  do Basqüadé nos cultivos celulares tumorais BW.

Com o mencionado ensaio constatou-se consistentemente a períodos de tempo crescentes, uma diminuição da viabilidade celular ou o que o mesmo, uma diminuição de células tumorais vivas.

Por tanto podemos concluir que Basqüadé não somente inibe o crescimento celular tumoral senão que também atua matando as células tumorais, propriedades que o convertem em um muito interessante medicamento antitumoral.